新冠肺炎的诊与疗诊断篇上

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浩悦资本创立于年，致力于成为嫁接中国医疗事业与资本的桥梁。浩悦资本的研究领域和交易范围覆盖生物医药、创新医疗器械、IVD与精准医疗、医疗服务和智慧医疗等多个细分领域。浩悦资本的团队由深耕中国医疗健康领域多年的资深投资银行家组成，长期密切追踪医疗健康投资市场动态和投资趋势，每周发布医疗健康投资周报和专题研究报告，以浩悦观点解读新政策和新前沿。

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作者/策划：浩悦资本生物医药行业组、IVD与精准医疗行业组

本文原创自浩悦资本，转载或合作请在本文末尾处留言。

也许多年以后的某一天我们可以自豪地宣布，由于医疗技术日新月异的进展，人类已经根除了所有传染性疾病。在那时，不知会有多少人想起，年1月23日，中国武汉这个一千一百万人口的城市一天之内宣布封城，目的是阻隔造成大规模人员感染与死亡的COVID-19病毒。

虽然COVID-19造成的余波仍然未能结束，但令我们鼓舞的是，奋战在抗疫一线的医疗行业研发人员和企业以前所未有的速度开发出了COVID-19病毒的检测试剂，并且紧锣密鼓的进行各种治疗手段的开发。对比年SARS病毒、年H1N1病毒和年MERS病毒，医疗技术的进步从某种意义上防止了COVID-19病毒在世界范围内更大的流行而造成更严重的损失。

浩悦资本IVD与精准医疗行业组和生物医药行业组以COVID-19和新冠肺炎专题报告的形式，为读者深度呈现对于本次疫情诊断和治疗有的全面理解和全新认识。

病毒的诊断

IVD与精准医疗

时间回溯至年12月30日，武汉华南海鲜市场出现首例不明原因的肺炎疫情，此后全国各地及多个国家陆续发现感染患者。年1月10日，上海市公共卫生临床中心和公共卫生学院与华中科医院、武汉市疾病预防控制中心、国家传染病预防控制所、中国疾病预防控制中心和澳大利亚悉尼大学合作，公开了冠状病毒基因组，病毒来源于此次在武汉爆发的呼吸道疾病的一个病例。该序列也已经保存在GenBank上（登录号为：MN）。面对来势汹汹的疫情，我国IVD企业快速响应，在病毒基因组公开后10天内，已有17家IVD企业陆续推出新型冠状病毒检测产品。截至目前，已有超过家国内IVD企业开始研发或推出新冠病毒检测产品。方法学覆盖了qPCR、数字PCR、mNGS、CRISPR以及传统的抗原方法。浩悦资本IVD与精准医疗行业组将对这些方法学的原理、主要企业和发展前景进行全面介绍。

1：CRISPR方法学

关键词：先进、准确、低成本

1）原理介绍与技术沿革

来源：腾讯视频，CRISPR-Cas9基因编辑的原理

（张锋参与制作）

CRISPR/Cas系统是目前发现存在于大多数细菌与所有古菌中的一种后天免疫系统，其以消灭外来的质体或者噬菌体并在自身基因组中留下外来基因片段作为“记忆”。

CRISPR/Cas系统全名为常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats/CRISPR-associatedProteins)。是细菌体内的获得性免疫系统，用于对抗侵入细菌的外源DNA、质粒和噬菌体等。CRISPR/Cas是获得性的免疫系统，细菌通过“记住”入侵过的外源DNA，并在它们再次入侵时切断他们的基因组，阻止其复制和表达，最终将其降解。

CRISPR/Cas技术的灵感来源于细菌的一种获得性免疫系统，与哺乳动物的二次免疫应答类似，细菌在抵抗病毒或外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，来抵抗该种外源遗传物质的再次入侵，而这种获得性免疫正是由细菌的CRISPR/Cas系统实现的；在细菌的基因组上，存在着串联间隔排列的“重复序列”，这些重复序列相对保守，我们称之为CRISPR序列。当细菌再次检测到入侵病毒的DNA时，该序列会表达产生CRISPRRNA，同时，CRISPR序列附近的保守蛋白编码基因（成为Cas基因）的表达产物（一种核酸酶）会和CRISPRRNA共同作用，识别入侵病毒的DNA靶序列并进行切割，降解外源DNA，实现对入侵病毒的免疫应答。

基于这一机制，科学家们开发出了CRISPR/Cas技术来利用RNA引导Cas核酸酶对多种洗标基因组的特定位点进行修饰编辑。目前，CRISPR技术的主要应用领域包括基因敲除动物模型、通过细胞诱导分化制造造血细胞、诱导癌细胞自毁等。而随着技术进步，与CRISPR序列配合的核酸酶也拓展到了Cas12、Cas13等。

由于使用方便、构建简单等特点，CRISPR被认为是遗传研究领域的革命性技术，已被广泛引用于基因编辑、细胞改造以及农业、医疗的多个细分领域。

目前已发现的CRISPR/Cas系统大体可分为两类，Class1（包含了typeI,III,andIV），和Class2（包含了typeII和typeV和typeVI）。在Class1中,对于外源基因组的剪切需要一个大的Cas蛋白复合物（由不止一种Cas蛋白组成）和引导RNA。在Class2中，对于外源基因的剪切只需要一个单一的剪切蛋白,例如TypeII中的Cas9蛋白和TypeV中的cpf1蛋白。

（图）CRISPR/Cas系统分类

来源：NucleicaciddetectionwithCRISPR-Cas13a/C2c2，JonathanS.Gootenbergetal.Science,Vol.,Issue,pp.-,28Apr

其中，以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心的TypeII组成较为简单，对于DNA的剪切只需要单一的Cas9蛋白或者cpf1蛋白，目前被积极的应用于遗传工程中。

那么，在新冠病毒的检测上，CRISPR技术可以起到怎样的作用？又有哪些代表性企业？

2）国际代表企业介绍

年2月，CRISPR技术的两位元老：MIT的张锋团队、UCBerkeley的JenniferDoudna团队都在《Science》上发表了基于CRISPR技术开发的全新诊断工具。

2.1SHERLOCKBiosciences

SHERLOCKBiosciences由MIT的张锋教授创立，张锋团队早在年就开发出了基于CRISPR-Cas13的检测RNA的技术，称为SHERLOCK(SpecificHighsensitivityEnzymaticReporterunLOCKingz，该方法原理是Cas13蛋白在人工设计的gRNA引导下，结合特异性RNA序列后，产生反式切割RNA探针的活性。该技术的核心是名为Cas13（早前被称为为C2c2）的CRISPR相关蛋白。

CRISPR-Cas13a能够用于切割细菌细胞中特定的RNA序列，与DNA靶向的CRISPR酶不同（如Cas9、Cpf1），Cas13a在切割了它的意向RNA目标后依然能够保持“活跃”，继续切割其他非目标RNA。这种现象被为“CollateralCleavage”。研究人员利用这一“脱靶缺陷”，加入一种带有RNA的荧光标记物，当标记物被切开时，会发出荧光信号而显示检测结果。该技术曾在过去几年爆发的埃博拉、登革热和寨卡等病毒疫情中发挥了重大作用。

年公开的新技术被称为SHERLOCKv2，与SHERLOCK相比，通过引入等温核酸扩增技术以及TypeIIICRISPR中的Csm6酶，其灵敏度提高了倍，同时由于引入了多种来自不同种属细菌的Cas13酶，该方法能在同一样品中检测出多种病毒感染，例如能同时检出寨卡和登革热病毒。

（图）SHERLOCK检测方法原理示意

来源：AnupdatedevolutionaryclassificationofCRISPR–Cassystems，EugeneV.Kooninetal.NatureReviewsMcrobiology13,-()

除了检测性能本身的提升，张峰团队在检测设备和手段上也取得了巨大进步：传统的SHERLOCK和DETECTR方法都以荧光信号作为判断依据。因此需要配套的荧光读取硬件。但张峰团队配合SHERLOCKv2方法，开发出了配套试纸，可在短时间内显示出检测结果，同时成本只需几美元。

（图）用于新冠病毒检测的SHERLOCK试纸

来源：FengZhangetal.AprotocolfordetectionofCOVID-19usingCRISPRdiagnostics

该试纸的显色原理是对“完整分子”和“切断分子”进行识别：理论上来说，只要监测样本里有特定病毒（如新冠病毒）的RNA，向导RNA就能对其进行精确的识别，并激活结合的Cas13a蛋白，不停的切断目标RNA。因此，如果样本里不存在新冠病毒，那么试纸上较低位置的“完整分子”标识会显色，反之，较高位置的“切断分子”标识会显色。该方法用时约1小时（扩增25分钟、切断反应30分钟、试纸检测2分钟）；据称，该方法检出限可低至每微升10个拷贝数。

2.2MammothBiosciences

由UCBerkeley的JenniferDoudna教授创立，Doudna团队发现CRISPR/Cas12a系统在剪切靶向的双链DNA的同时，其核酸酶会被激活，该酶可以非特异性的切割单链DNA。因此，向目标细胞传递特定的靶向DNA（比如针对某种病毒）的CRISPR-12Cas12a系统和非特异性单链DNA荧光报告基因，一旦检测到目标DNA，CRISPR-Cas12a系统将启动，与此同时，荧光报告基因也会被降解，从而释放出荧光信号。

该团队基于该现象开发了新型的病毒感染诊断工具。并结合等温核酸扩增技术提高了灵敏度。该技术被称为称为DETECTR(DNAEndonuclease-targetedCRISPRTransReporter)；该技术号称单次检测成本不到1美元，用时一个小时。

DNA和RNA之间很容易实现相互转换，因此这两个技术对于DNA和RNA都可检测。同时，SHERLOCK与DETECTR主要的不同在于张锋团队设计的荧光报告基因必须是特异性的，DETECTR是非特异性的，因此SHERLOCKv2可以同时检测多种序列。

（图）DETECTR检测方法原理示意

来源：Doudnaetal.CRISPR-Cas12atargetbindingunleashesindiscriminatesingle-strandedDNaseactivity.Science.Apr27;():-.

2）国内相关企业介绍

疫情来袭之时，以上海吐露港生物(ToloBiotech)为代表的一批国内CRISPR诊断企业也进行了快速的响应。吐露港生物成立于年，是一家专注于分子诊断试剂和原料的企业，与中科院联合开发了拥有独家专利的基于CRISPR-Cas12的技术，命名为HOLMES(One-HOurLow-costMultipurposeHighlyEfficientSystem)，专用于检测特异性DNA。

疫情来袭之时，以吐露港生物科技公司为代表的一批国内CRISPR诊断企业也进行了快速的响应，并陆续推出了各自的快速诊断产品。吐露港公司成立于年底，创始人团队来自于中科院合成生物学重点实验室；公司的目标是致力于为分子诊断提供创新型解决方案。

该公司首次发现CRISPR-Cas12蛋白的高效反式切割活性，并基于该酶的独特优势研发了“HOLMES”核酸快速检测平台。相比于传统的分子诊断技术，基于CRISPR的HOLMES技术具备高灵敏、高特异、快速和低成本等优势。正因如此，此类技术也被美国《Science》杂志誉为“下一代分子诊断技术”，在病原菌检测、疾病筛查、精准医疗等众多领域有很大的应用潜力。

吐露港公司拥有Cas12蛋白在核酸检测方面的应用专利，并获得了源自美国博德研究所的CRISPR-Cas12蛋白的基础专利在大中华区（包括香港、澳门和台湾）的独家许可授权。同时，吐露港公司也授权了由MIT张锋教授领头创立的SherlockBiosciences公司在美国独家使用吐露港公司的HOLMES专利技术。在新冠疫情爆发后，吐露港联合华大智造迅速推出了基于HOLMES专利技术和华大智造微流控芯片的新型冠状病毒快速检测系统，实现了在一小时内完成基于芯片的病毒核酸提取、HOLMES检测和结果判读，并通过“全封闭“、”全自动“的检测方案的设计显著降低了医护人员在病毒检测过程中被感染的概率。

3）小结

由前文可见，CRISPR方法用于新冠检测，拥有快速、低成本、高灵敏度、低检出限的特点。尽管需要扩增限制了其在缺少供电或野外等环境下的使用，但对于疾控中心和基层医疗机构而言，在今后的流行病高发季节或突发传染病情况下，都会是一种廉价、快速、可靠的检测手段。同时，CRISPR具备的超高灵敏度和特异性，可以有效诊断无明显症状或核酸检测呈阴性的患者。

2：抗体方法学

关键词：成熟、安全、简便、互补

1）原理介绍与技术沿革

灵长类动物主要有四种免疫球蛋白IgG、IgM、IgA和IgE。其中IgG抗体是免疫球蛋白G(ImmunoglobulinG,IgG)的缩写，是抗体中分子量最小的一种，是血清主要的抗体成分，约占血清Ig的75%。其中40～50%分布于血清中，其余分布在组织中。IgG是唯一可以通过胎盘的免疫球蛋白。该抗体产生晚，维持时间长，消失慢，浓度高。血中检测到可作为远期感染指标。

IgG的功能作用主要在机体免疫中起保护作用，大多数抗菌、抗病毒；应对麻疹、甲型肝炎等，能有效地预防相应的感染性疾病。其指标对于诊断某些疾病具有意义。IgM抗体是免疫球蛋白M(ImmunoglobulinM)的缩写，是抗体中分子量最大的一种，不能通过胎盘输给胎儿。抗体产生最早，一经感染、快速产生，在感染初期抗感染起作用。但维持时间短，消失快。病毒感染人体后，病毒抗原可在1~5天产生，其中IgM抗体约在5~7天产生，维持时间短，消失快，血液检测阳性可判断早期感染，有利于早发现、早治疗。而IgG抗体在10~15天产生，可在血液循环中保持较长时间存在，血液检测阳性则可作为已感染或曾感染的指标。

（图）IgM/IgG可在感染的不同阶段作为指标出现

来源：Sifted.eu

作为人体免疫响应的主要指征，这两种球蛋白一般通过免疫诊断的方法进行检测，常用的检测方法学平台包括胶体金、免疫荧光和化学发光等。

（表）常用的免疫诊断方法简介

来源：浩悦资本整理

那么，作为相对较为成熟的方法学，IgM和IgG对于新冠检测有什么意义？

通俗地讲，如检出IgM抗体，通常表明处于感染初期；检出IgG抗体，通常表明处于治愈过程之中；如果IgM和IgG双阳，往往表示人体免疫系统仍在与病毒搏斗。基于以上原理，IgM/IgG抗体检测试剂盒有助于将诊断时间前移。越早确诊，越可更大程度减少人传人，这对疫情防控具有十分重要的意义。

近日，国家卫健委发布了《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》，其中诊断标准在原有核酸检测和测序基础上增加了“血清学检测”作为依据。抗体检测具有操作便捷、检测迅速的特点，是对核酸检测不足的补充。抗体检测的样本包括血清、血浆和全血，检测的抗体主要分为IgM和IgG两类。作为核酸诊断的补充手段，可有效判断早期感染，并分辨“曾经”感染的人群。

2）国际代表企业介绍

此次疫情爆发后，截止报告发布日，国际免疫诊断巨头企业如罗氏、雅培等，尚未发布与新冠病毒相关的抗体诊断产品，而各国卫生部门提出的诊断方案也都是以PCR核酸检测为主。这一点充分反映了我国政府机关、医疗机构和诊断产业相比国外同行，能够做到迅速响应，实事求是，也正是因为如此，为全球抗疫争取了宝贵的时间和经验。

3）国内相关企业介绍

3.1博奥赛斯

博奥赛斯成立于年，总部位于天津，是一家专注于化学发光体外诊断试剂和设备开发生产的企业，拥有国内唯一一个自主研发并推出的全自动化学发光流水线产品，在我国第三方临检中心及体检中心市场化学发光产品占有率居国产品牌第一。3月1日，博奥赛斯联合重庆医科大学推出了国内首款获批上市的化学发光法新冠病毒抗体检测产品。

在新型冠状病毒肺炎疫情爆发后，博奥赛斯与重庆医科大学共同承担了重庆市抗新型冠状病毒重点应急攻关“-nCoV免疫诊断试剂盒”研究项目。该项目由中华医学会微生物学与免疫学分会主任委员黄爱龙教授领衔，依托重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部实验室（国家卫生部生物安全应急网络实验室）和博奥赛斯联合成立“疫情防控应急科技攻关小组”，开展攻关研发。团队于2月10日成功开发出基于多种方法的新冠病毒抗体检测试剂，其中基于磁微粒化学发光法的两款产品在本次应急审批中成功通过获准上市。

3.2万孚生物()

广州万孚生物技术股份有限公司成立于年，公司于年6月30日在深圳证券交易所创业板上市。公司致力于POCT试剂和仪器的研发、生产和销售，为顾客提供专业的快速诊断与慢病管理的产品和服务。

公司构建了完善的胶体金与胶乳标记层析技术平台、荧光标记定量检测技术平台、干式生化以及电化学定量检测、分子诊断等技术平台，产品涵盖传染病、妊娠、心血管疾病、毒品、肿瘤疾病、代谢疾病等业务领域。百余医院、社区门诊、卫生院、OTC药房以及疾病控制中心、公安、军队等特殊渠道。是我国IVD行业的代表企业之一。

2月22日，万孚生物新冠病毒抗体检测试剂盒（胶体金法）获得注册证，该产品用于体外定性检测人血清、血浆、静脉全血样本中新型冠状病毒(-nCoV)抗体，操作简单，15分钟即可肉眼判读结果，可为新冠肺炎疑似患者提供快速检测手段。

4）小结

抗体检测方法的主要优势在于快速、简便（一般耗时约20分钟）、对于环境要求低（相对于核酸检测），因此适合基层医疗机构广泛开展检测；另外，采用血液血清检测，相比需要使用鼻腔/咽喉拭子的核酸检测意外感染的风险更低。由于抗体的特异性，可以有效避免病毒含量低或采样问题导致的漏检，同时，很多治愈患者出院后存在核酸检测转阳的情况，加做病毒抗体Ig-M与Ig-G的检查，能够确保大家彻底治愈，避免患者重新入院治疗。所以抗体检测不仅可判断早期感染，及时确诊或排除患者、疑似患者，有利于早发现、早治疗，而且也是患者出院的重要依据。但有些免疫功能较弱的病人可能抗体量很低，容易造成假阴性。在新冠病毒感染之初，如果病原体抗原含量也较低，同样会因不容易检测而导致漏检。因此几种检测方法需要结合使用以达到最佳效果。

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