丹酚酸B鼻腔给药对脑缺血损伤大鼠学习记忆

近年来，鼻腔给药用于治疗中枢神经系统疾病的研究日益受到重视，鼻腔给药后，药物可以通过多种途径入脑而发挥疗效。传统中医学认为鼻与脑息息相关。陈士铎在《辨证录》中有“鼻窍通脑”之说，《医林改错》中云：“鼻通于脑，所闻香臭归于脑”，上述记载描述了中医理论中有关鼻与脑的重要关系。近年来，药物经鼻入脑的给药方式成为国内外中枢神经系统疾病给药方式研究的热点，相比传统的口服或iv而言，鼻腔给药具有明显的优势：避免首关效应，提高生物利用度；药物吸收快，起效快；使用方便，患者依从性好；有利于脑内药物浓度的提高[1]。

丹酚酸B（salvianolicacidB，SalB）是从活血化瘀中药丹参SalviamiltiorrhizaBge.中分离的主要水溶性酚酸类化合物。目前大量基础与临床研究表明丹酚酸B对中枢神经系统，尤其是脑缺血损伤具有很好的疗效[2-5]。前期体外实验研究结果显示，丹酚酸B可以促进神经干细胞增殖，且其促增殖效应具有时效和量效关系[6]。但由于丹酚酸B化学结构及稳定性等问题，关于其能否透过血脑屏障（BBB）而直接发挥作用尚无明确报道。在前期实验的基础上，本研究考察了丹酚酸B鼻腔给药后大鼠海马组织中的药物浓度，进一步考察了鼻腔给药丹酚酸B对脑缺血损伤大鼠学习记忆能力的影响，并从神经再生角度初步探讨了其作用机制，以期为治疗脑卒中恢复期及后遗症中药新药研发提供依据。

1材料

1.1动物

雄性SD大鼠，体质量～g，购于北京维通利华实验动物有限公司，合格证号SCXK（京）-。

1.2药物与试剂

丹酚酸B（质量分数＞98%，批号MUST-，成都曼斯特生物科技有限公司）；乙腈、甲醇等色谱纯试剂及BrdU、小鼠抗BrdU单克隆抗体（Sigma公司）。

1.3仪器

岛津LC-A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；色谱柱为迪马公司C18柱（mm×2.0mm，5.0μm）；Morris水迷宫（淮北正华生物仪器设备有限公司）；CM冷冻切片机（Leica公司）。

2方法

2.1鼻腔给药后大鼠海马组织中丹酚酸B的测定

将丹酚酸B加入3%羧甲基纤维素钠中制得鼻用凝胶制剂。正常大鼠用10%水合氯醛（3mL/kg）麻醉，切开颈部皮肤，暴露气管和食管，取聚乙烯管通过食道插至鼻腔后部，注射器进行给药（μL/只）。分别于给药后10、30、60、、、、min（每个时间点6只大鼠）0.9%生理盐水心脏灌流，取脑并剥取海马组织，按1∶2加入生理盐水制备匀浆液。利用HPLC方法[7]测定海马组织中丹酚酸B的峰面积，利用回归方程求得海马组织中丹酚酸B的质量浓度。

2.2实验性脑缺血大鼠模型的复制

采用四动脉结扎法复制实验性脑缺血大鼠模型，将实验大鼠用10%水合氯醛（3mL/kg）麻醉，暴露第一颈椎横突翼，并找到左右横突孔，用高频电刀永久性阻断椎动脉血流。24h后，在大鼠清醒状态下，用动脉夹夹闭两侧颈总动脉，造成四血管关闭，精密计时6min后，开启动脉夹，恢复血液供应。实验过程中，保持肛温（37.0±0.5）℃，以大鼠出现意识消失、眼球苍白、瞳孔散大、呼吸加深加快，对疼痛刺激无反应、翻正反射和瞳孔对光反射消失为模型成功标志，弃除模型不成功动物。

2.3Morris水迷宫实验

实验分为假手术组、模型组、丹酚酸B鼻腔给药组。假手术组和模型组鼻腔给予3%羧甲基纤维素钠，丹酚酸B给药剂量为50mg/kg（预试验确定的合适剂量），于脑缺血1周后开始给药，每天1次，连续给药3周后进行Morris水迷宫实验。分别利用定位航行实验的逃避潜伏期和空间探索实验的平台所在象限时间及跨越平台次数评价鼻腔给予丹酚酸B对脑缺血大鼠学习记忆能力的影响。

2.4甲酚紫染色

甲酚紫染色是标记神经元尼氏体的主要手段之一，正常脑组织经甲酚紫染色后尼氏小体呈紫色，胶质细胞呈淡紫色，背景无色。各组大鼠在行为学检测结束后给予10%水合氯醛ip麻醉后，用0.9%生理盐水经心脏灌注，后用4%多聚甲醛灌注，经蔗糖逐级脱水后将脑组织行冰冻切片，采用甲酚紫染色法考察丹酚酸B鼻腔给药对脑缺血损伤大鼠海马区形态学特征的影响。

2.5BrdU染色

于Morris水迷宫实验结束前1dipBrdU（每次50mg/kg）标记增殖细胞。ipBrdU标记4次，每次间隔2h。实验结束后首先用0.9%生理盐水经心脏灌注，后用4%多聚甲醛灌注固定。经蔗糖逐级脱水后将脑组织冰冻切片，采用免疫组织化学染色法检测脑缺血损伤大鼠海马区BrdU阳性细胞数目，考察丹酚酸B鼻腔给药对脑缺血损伤大鼠神经再生的影响。

2.6统计学处理

采用SPSS17.0软件处理数据，数据采用表示，组间比较采用t检验。

3结果

3.1丹酚酸B鼻腔给药后不同时间大鼠海马组织中的药物浓度

本研究建立了测定大鼠海马组织中丹酚酸B质量浓度的HPLC方法，选择氯霉素作为内标，经方法学验证，线性关系、日内精密度、日间精密度和回收率均符合要求，可用于测定丹酚酸B在海马中的质量浓度，色谱图见图1。结果显示，鼻腔给药能使丹酚酸B在海马组织中呈现一定浓度的分布，并且可在3h左右达到峰值（表1）。丹酚酸B鼻腔给药后海马组织中达峰浓度（Cmax）为（2.47±0.55）μg/g，曲线下面积（AUC）为（.4±73.0）μg?min/g。

3.2丹酚酸B鼻腔给药对脑缺血损伤大鼠空间学习记忆能力的影响

在定位航行实验中，随着训练次数的增加，各组大鼠平均逃避潜伏期均有所减少。与假手术组比较，模型组大鼠训练期间每天的平均逃避潜伏期显著延长，显示模型组大鼠存在记忆能力下降；与模型组比较，丹酚酸B鼻腔给药组的平均逃避潜伏期随训练时间的后延而缩短，显示丹酚酸B鼻腔给药在一定程度上改善脑缺血损伤大鼠的学习记忆能力。结果见表2。

在空间探索实验中，模型组大鼠在原平台象限停留时间较假手术组明显缩短，显示脑缺血在一定程度上造成大鼠学习记忆能力下降；丹酚酸B鼻腔给药组在原平台象限停留时间有所延长；丹酚酸B鼻腔给药组表现出更好的定位性和趋向性，能依靠空间线索找到平台，游泳轨迹以原平台象限占优势，其次较多地在原平台象限相邻的左右两侧象限寻找，很少跨至对侧象限，而模型组大鼠基本围绕池壁游泳，较少游向原平台附近，其运动轨迹呈随机分布于各象限之中。模型组跨越原平台次数较假手术组显著减少（P＜0.01），丹酚酸B鼻腔给药组跨越原平台次数较模型组增多（P＜0.05）。结果见表3。

3.3丹酚酸B鼻腔给药对脑缺血损伤大鼠海马区形态学特征的影响

甲酚紫染色结果显示，假手术组大鼠海马形态完整，结构清晰，神经细胞排列规则，CA1区神经细胞为4～5层，且排列整齐，尼氏体呈均匀的蓝紫色着色，数量较多且胞体较大。模型组大鼠海马CA1区细胞层数减少，锥体细胞数目明显减少，神经元细胞间隙变大，且排列不规则，细胞皱缩，甚至出现脱失和中断，部分细胞可见胞体肿大及核裂解和碎裂现象。与模型组比较，丹酚酸B鼻腔给药组海马形态结构清晰，神经细胞排列较规则，神经元数目明显增多。见图2。

3.4丹酚酸B鼻腔给药对脑缺血损伤大鼠海马区神经干细胞增殖的影响

免疫组织化学染色结果显示，与假手术组比较，模型组的BrdU阳性细胞数目无明显变化；与模型组比较，丹酚酸B可以显著增加脑缺血损伤大鼠海马区域细胞增殖标志物BrdU阳性细胞数目。结果提示丹酚酸B鼻腔给药能促进脑缺血损伤大鼠海马区神经干细胞的增殖。见图3和表4。

4讨论

由于血脑屏障（BBB）的存在，极大地制约了药物直接进入中枢神经系统疾病发挥作用。鼻腔给药是治疗中枢神经系统疾病的一种有效给药方式[8]，越来越受到人们的